本文作者：吕欣
医院脊柱外科，八年制博士在读，师从国内脊柱外科专家王冰教授
王冰，教授、主任医师，博士生导师。现任医院脊柱外科和湖南省脊柱外科治疗中心副主任，脊柱外科研究室主任。担任中国康复医学会脊柱脊髓专业委员会青年委员会副主任委员；中国医促会骨科疾病防治委员会脊柱内镜学组副主任委员；中国医师协会骨科分会微创专委会微创融合学组副组长；中华中医药学会脊柱微创专委会常委暨经皮内镜技术研究组副主任委员；医院学会脊柱外科专业委员会脊柱畸形学组副组长，中华医学会骨科分会基础学组委员；中国骨科菁英会脊柱创始会员和执委；中国SICOT骨科分会基础学组常务委员；国际侧方入路手术学会中国部副主任委员；AOSpine中国部讲师；中国脊柱脊髓杂志常务编委；国际TheSpineJournal和Spine杂志中文版编委；湖南省康复医学会脊柱脊髓专委员主任委员；湖南省医学会骨科分会常委；湖南省遗传学会常务理事；白求恩公益基金会骨科基层教育委员会常委和手术指导专家等职。擅长内镜微创脊柱外科和各类复杂脊柱畸形的矫治。在国家级和国际核心刊物上以第一作者和通讯作者发表论文余篇，SCI论文30余篇,主编和参编专著10余部，主持国家自然科学基金4项。
前言
先天性脊柱侧凸（Congenitalscoliosis,CS）是指由于先天脊柱发育畸形导致脊柱发育不平衡而引起的脊柱侧凸，在全世界发病率为0.5-1/0，以半椎体畸形最为常见。相比于其他类型的脊柱侧凸，CS进展更快，多需要手术干预。既往研究表明，CS的发病与多个基因相关，其中，位于16p11.2位点的基因TBX6对于旁轴中胚层的分化和分离至关重要，是CS的良好候选基因，对中国CS患者进行基因组分析发现，TBX6无效突变的等位基因通常为同一单倍型，由此推测TBX6基因对CS发病的影响是由罕见的无效突变和常见的TCA单倍型杂合引起的。年，日本RIKEN骨关节实验室的IkegawaShiro教授团队在日本患者中对该复合杂合模型进行了验证，同时探究了TBX6基因其他突变类型在CS发病中的意义，并于年对TBX6基因功能丧失的机制进行了进一步探讨，对CS的严重形式——脊柱-肋骨发育不良（Spondylocostaldysostosis，SCD）与TBX6之间的关系进行了探究。本文对Ikegawa教授团队的两篇文章进行解读，旨在使读者对TBX6基因功能性突变在脊柱畸形中的作用有所认识，有所启迪。
文献一：
TBX6基因中的无效突变和危险单倍型的复合杂合性导致先天性脊柱侧凸
1.研究对象
94名由专业脊柱外科医生和儿科医生诊断的CS患者，已接受临床及影像学检查。
剔除标准：综合征性脊柱侧凸，包括Alagille综合征，Goldens综合征，Jarcho-Levin综合征，Klippel-Feil综合征，SOTOS综合征和联合畸形等。
2.研究方法与结果
（1）TBX6突变分析
对94名CS患者的临床数据进行整理，发现有9名患者存在TBX6基因突变，其中5名为杂合缺失（表1）。测定以CS为主要表现的8名患者TBX6拷贝数，发现与对照组相比，5名杂合缺失患者TBX6拷贝数明显减少，而其他突变类型未对拷贝数造成影响（图1A）。2名患者经微阵列CGH鉴定发现了包括TBX6在内的16p11.2位点kb缺失（图1B）。对剩余3名存在其他类型突变的患者进行基因测序，发现其分别存在核苷酸替换、缺失和删除（图1C-E）。
表1.TBX6突变的CS患者临床数据
图1.日本CS中的TBX6突变分析
（2）常见的TBX6单倍型分析及突变体有害性预测
经测序，本次研究中8名具有TBX6突变的患者均有等位基因TCA单倍型，其中CS号为错义突变（表2），编号CS患者家系亦符合复合杂合遗传模型（图2A~B），计算机分析预测多数错义突变亦具有“有害性”，不具有TCA单倍型的突变中仅1种预测为“有害”。
表2.CS中错义突变体的基因型致病性预测
图2.CS患者谱系图及表型
（3）TBX6体外功能分析
体外检测TBX6突变体的转录活性，发现等位基因为TCA单倍型的编号CS的错义突变体转录活性降低，而引起更严重表型的插入突变不仅转录活性低，亦对野生型TBX6的转录具有抑制作用。
图3.TBX6突变体转录活性检测
3.研究结论
研究结果显示，复合杂合模型同样适用于日本同类CS患者，而具有TBX6插入突变的患者表型上更接近脊柱-肋骨发育不良，可以进一步探讨TBX6与SCD发病之间的关系。
文献二：
TBX6的双等位基因功能缺失性突变引起脊柱和肋骨畸形，包括先天性脊柱侧凸和脊柱-肋骨发育不良
1.研究对象
名CS患者和4名SCD患者，剔除标准与上文相同。
2.研究方法与结果
（1）TBX6突变分析
对名患者的临床数据进行整理并进行基因测序，发现有9名CS患者存在TBX6基因突变，其中5名为杂合缺失、1名为剪接位点突变、3名为错义突变，且均有等位基因风险单倍型；1名SCD患者存在TBX6双等位错义突变（表3）。经计算机分析，多数突变体具有“致病性”。
表3.存在TBX6突变的CS及SCD的临床数据和基因型
（2）TBX6体外功能分析
体外测定错义突变体的转录活性，发现仅少数种类转录活性降低（图4A~B）。对剩余突变种类的细胞进行免疫荧光染色，发现突变体引起TBX6蛋白错误定位（图4C~D）。
图4.体外测定TBX6错义突变体功能
（3）SCD患者人类iPs细胞诱导的原始中胚层细胞中TBX6的表达
从SCD患者建立iPS细胞，检测TBX6基因在分化的不同阶段的表达情况（图5A），发现TBX6基因在原始中胚层阶段转录活性明显降低，对原始中胚层细胞进行免疫荧光染色，发现存在与错义突变体相同的蛋白定位错误（图5B）。
图5.SCD患者的TBX6表达情况
3.研究结论：
结果显示，TBX6错义突变可通过与单倍型复合杂合遗传引起CS，其机制可能是转录活性的降低或蛋白的错误定位，而TBX6的双等位错义突变可能是引起SCD的原因。TBX6的双等位基因功能性突变可造成CS、SCD等一系列畸形，取决于体节形成过程中TBX6功能丧失的严重程度。
总结
上述两篇文献是系列连续研究结果，文章2对文章1的推论进行了证实，并进一步探究了TBX6突变引起脊柱畸形的机制，包含DNA、RNA和蛋白等多个水平的检测，更确切地揭示了TBX6基因在脊柱发育过程中的作用。目前对基因与脊柱疾病之间相关性的研究鳞次栉比，本文赏析的两篇文章中所述的研究方法值得借鉴，并且将TBX6的影响从CS扩展至SCD，启示我们应从研究中发现问题，在科研中要“刨根问底”，融会贯通。
参考文献
1.McMaster,M.J.andK.Ohtsuka,Thenaturalhistoryofcongenitalscoliosis.Astudyoftwohundredandfifty-onepatients.JBoneJointSurgAm,.64(8):p.-47.
2.Liljenqvist,U.,[Thenaturalhistoryofcongenitaldefectsanddeformitiesofthespine(I)].Versicherungsmedizin,.56(4):p.-7.
3.Bulman,M.P.,etal.,Mutationsinthehumandeltahomologue,DLL3,causeaxialskeletaldefectsinspondylocostaldysostosis.NatGenet,.24(4):p.-41.
4.Wu,N.,etal.,TBX6nullvariantsanda
